线粒体代谢调控组织损伤修复不同阶段中巨噬细胞功能转换-利来w66

组织结构和功能损伤修复是一个基本的生物学过程，是生命体生存所必需的。损伤修复分为两个阶段，促炎阶段（抗菌防御）和促修复阶段（组织生长和分化）。在这个过程中，参与损伤修复的mφ（wound mφ, 伤口mφ）需要应对损伤组织的微环境并迅速调整状态来行使其功能。具体来说，损伤发生后，外周血单核细胞被招募到损伤部位，激活为1型mφ，1型mφ具有促炎和促血管生成特征，参与微生物抵御、促进组织血管化和受损组织的再生生长。在第二阶段，mφ激活为2型，促进瘢痕形成和修复。然而，伤口mφ从促炎1型到促修复2型转变的分子调控机制仍不清楚。

单核细胞/巨噬细胞（mφ）是参与机体损伤修复的重要免疫细胞。一些研究（主要是体外研究）表明，在mφ激活过程中伴随着细胞代谢重编程。理解这个重编程过程会为促进组织的修复、再生能力提供理论基础。然而，在组织损伤修复过程中不同阶段的mφ的代谢重编程、信号调控、活化类型之间的关系仍不明确。

最新研究

2021年8月28日，来自科隆大学的sabine a. eming团队在cell metabolism 上发表了题为《mitochondrial metabolism coordinates stage-specific repair processes in macrophages during wound healing》的文章，作者发现早期和晚期伤口mφ在转录和代谢方面存在显著差异，早期mφ不仅需要糖酵解功能，还依赖线粒体产生的活性氧的来稳定hif-1α促进促炎症、促血管生长；晚期mφ依赖于m2型信号-il-4ra受体-氧化磷酸化途径增强修复功能。该发现揭示了愈伤过程中巨噬细胞代谢重编程的机制与意义，提供了促进伤口mφ功能的新靶点。

伤口mφ在损伤早期和晚期呈现不同的代谢模式和基因表达模式

为了研究伤口mφ（cd45 cd11b f4/80 细胞）在整个损伤修复期间的代谢特征，作者使用了c57bl/6野生型小鼠背部全层切除皮肤损伤模型，从炎症早期（损伤后4天）和瘢痕形成晚期（损伤后14天）的创面组织中分离出mφ。作者首先测定了细胞耗氧率（ocr）和基础细胞外酸化率（ecar），发现与早期伤口mφ相比，晚期伤口mφ有更高的基础呼吸、atp周转率和剩余呼吸能力，并且糖酵解程度明显较低。mito-trackertm green （mtg）荧光染色显示，晚期mφ中有更多的线粒体，这与其较高的ocr一致。综上所述，早期和晚期的伤口mφ能量代谢特征有显著差异，晚期mφ较高的氧气消耗可能是由于线粒体重量增加和oxphos上调引起的。

那么代谢模式重编程是由转录组的重编程引起的吗？rna-seq结果提示愈伤早期和晚期mφ的基因表达谱有显著的差异，在早期mφ中促炎相关基因（nos2和ptgs2）和促血管生成（vegfa）基因高表达，在晚期mφ中2型细胞因子相关基因 （ccl22、ear2 irf4, mgll, mgl2, mrc1和retnla）高表达。

通路富集的结果与两种mφ代谢模式也是一致的：早期mφ表现出糖酵解/糖异生和hif-1信号相关基因和通路的富集，和线粒体相关的代谢过程有血红素代谢、柠檬酸代谢和琥珀酸代谢；而晚期mφ在2型细胞因子诱导的途径中富集，表现出更高的脂肪摄取和分解代谢，和线粒体相关的代谢过程有肉碱代谢、线粒体蛋白质翻译的trna氨基酰化、atp运输和线粒体dna复制。上述结果表明伤口mφ在早期和晚期有不同的基因表达模式和代谢模式。

伤口mφ的亚群异质性

为了进一步解析不同时期伤口mφ中基因表达和代谢模式的异质性，作者对早期和晚期伤口mφ进行了单细胞测序（scrna-seq）分析。结果显示mφ可以分为7个群。早期mφ以2群和3群为主，而晚期mφ以0群、1群和6群为主，这提示mφ的细胞类型在伤口愈合的不同时期存在异质性。对各个群中早期、晚期伤口mφ做特征评分发现，同一个群中早期mφ细胞的m1和糖酵解特征评分更高，晚期mφ细胞的m2和oxphos特征评分更高，这与rna-seq的结果是一致的，表明伤口愈合过程中mφ从m1/糖酵解型向m2氧化型mφ转变。

损伤早期，线粒体呼吸链调控mφ的促炎、促血管生成功能

线粒体呼吸链（mrc）在调控mφ极化的代谢重编程中发挥重要作用。那么，在伤口愈合过程中mrc如何调节伤口mφ的极化呢？

有研究报道，dars2基因编码线粒体天冬氨酸-trna合成酶2，是调控线粒体内的呼吸链相关蛋白质合成的关键基因。作者通过条件性敲除dars2构建了髓系细胞mrc失活的小鼠模型。作者用lps ifn-g处理骨髓来源的巨噬细胞（bmdm ）[m(lps ifn-g)]，发现lps ifn-g显著诱导了wt bmdm中促炎因子基因（il1b, il6和tnfa）的表达，而在dars2 ko 的bmdm中促炎因子变化不显著。此外，retnla、arg1和chil3在用il-4 il-13处理bmdm [m(il-4 il-13)]诱导的wt bmdm中显著升高、在dars2 ko bmdm中变化不显著。这些发现表明在体外dars2调控bmdm的促炎、促修复表型极化。

那么，mrc失活会影响伤口mφ的体内修复功能吗？作者发现，与wt 小鼠相比，dars2 mko 小鼠的mφ中ndufb8 （ci）的蛋白水平显著减少、uqcrc2 （ciii）和cox1 （civ）的蛋白水平有一定程度的减少，这表明dars2 ko mφ确实发生了mrc缺陷。接下来，作者分析了dars2 mko小鼠的伤口愈合和组织恢复能力是否受到了影响。组织形态学分析显示，与对照组小鼠相比，dars2 mko小鼠的伤口闭合显著延迟，存在肉芽组织显著减少、结痂脱落延迟和早期创面血管化显著减少等特征，表明mrc失活会削弱伤口mφ的体内修复功能。有趣的是，dars2 mko小鼠在第4天和14天时创面mφ数量和wt小鼠相当。这表明mrc缺陷并未影响血液单核细胞招募到损伤部位。

那么mrc影响伤口mφ功能的机制是什么？髓系细胞中hif-1α介导表达的vegfa是组织修复中促血管生成的关键细胞因子，前期rna-seq结果提示vegfa在早期mφ中高表达。作者进一步发现早期dars2 mko小鼠的mφ中hif-1α靶基因水平表达显著降低（包括vegfa、糖酵解和促炎基因），提示hif-1α通路可能参与了mrc对mφ功能的调控。

早期mφ通过mrc产生ros来稳定hif-1α以促进血管生成

先前有研究发现，用lps处理bmdm时，线粒体膜电位（mmp）增加，mrc的功能从产生atp转向琥珀酸氧化，两者提供了反向电子传递的驱动力，琥珀酸氧化导致ros产生从而促进hif-1α的稳定和il1b的表达。

作者首先利用四甲基罗丹明甲酯（tmrm）染色和流式检测分析了wt和dars2 mko 小鼠的bmdm的mmp，发现空白处理时，wt和dars2 ko bmdm的mmp相似，但是lps刺激时，wt和dars2 mko mφ中mmp增加程度也相当，表明dars2 mko 不影响bmdm mmp变化。

接下来，作者用mitosox染色评估细胞mtros的产生，lps刺激后，wt bmdm 中mitosox 细胞比例比空白对照增加了约2.6倍，而dars2 ko bmdm中mitosox 细胞比例显著低于wt bmdm。检测过氧化物清除基因发现，在体外dars2 ko bmdm（lps ifn-g）中和体内dars2 mko小鼠早期伤口mφ中，gclc、gclm、gsr和sod2的表达显著降低。这表明，dars2敲除不影响bmdm中线粒体mmp但是显著降低了线粒体产生mtros的能力。

那么mtros产生能力的降低是mrc损伤引起的吗？对hif-1α又有什么影响？非变性凝胶电泳显示，与wt bmdm相比，dars2缺陷bmdm中ci、ciii和civ严重受损，在lps 琥珀酸处理时hif-1α依然发生降解。这表明，dars2 ko mφ中的mrc功能受损导致mtros产生能力降低，进一步导致hif-1α稳定性降低，导致早期伤口mφ促炎症和促血管生成功能的减弱，进而影响早期的损伤修复。

早期mφ产生mtros的细胞亚群

作者进一步分析了scrna-seq数据中每个亚群的血管生成特征评分，发现mφ的血管生成评分在4 天和14 天时显著增加；对单个亚群分析发现，不同亚群的血管生成评分存在异质性，第3亚群的血管生成评分最高。有趣的是，血管生成评分与oxphos评分呈负相关，这表明愈伤相关的mφ血管生成并不依赖于oxphos。

接下来，作者分析了每个亚群中与mtros产生、炎症和血管生成相关基因的表达情况。在4天时，il1b、vegfa、hif1a、ldha和slc2a1基因以及ros清除基因gclc、gclm、gsr、sod2和nfe2l2主要富集在0、2、3和5亚群中。值得注意的是，第3个亚群中idh1下调、而acod1上调，这是m1样mφ的特征并且反映了第3个亚群中tca循环的下调。综上所述，第3个亚群可能是愈伤早期mφ重编程线粒体代谢产生mtros的细胞类型。

il-4ra诱导的线粒体生物发生和oxphos在2型mφ活化中起重要作用

那么在创伤修复晚期mrc有怎样的功能呢？作者发现，dars2 mko小鼠的晚期mφ中mrc蛋白水平与早期mφ没有差异，但是晚期mφ却确实呈现 2型功能。与此同时，体外il-4诱导m2型极化实验中，dars2缺陷bmdm的m2极化受损。这些结果提示，在体内，损伤修复后期dars2 ko mφ中可能存在mrc的代偿机制。

作者进一步利用il4在体诱导m2极化动物模型探索mrc功能及代偿机制。il-4c可诱导局部mφ增殖和m2型激活，作者通过小鼠腹腔注射il-4c刺激构建2型免疫刺激模型，发现wt小鼠中il-4c处理导致mφ数量增加，而dars2 mko小鼠mφ数量增加弱于wt小鼠。流式分选腹膜mφ做免疫印迹分析显示，生理盐水处理的dars 2 mko小鼠的ndufb8、uqcrc2、cox1蛋白水平比wt小鼠低，而il-4c处理的dars 2 mko小鼠的oxphos亚基的蛋白水平比生理盐水处理组显著升高，并且il-4c处理的wt小鼠和dars2 mko小鼠有相似的retnla、arg1和chil3表达。这些结果表明，在dars2 mko小鼠的mφ中m2型信号可能是通过il-4-oxphos途径激活了线粒体代偿功能。

为了证实在晚期伤口mφ中oxphos受到il-4信号调控，作者首先分析了il-4 il-13刺激的wt bmdm线粒体的量，与对照组相比，il-4 il-13刺激的bmdm中线粒体显著增加，这表明m2型信号诱导了线粒体生物发生。

接下来，作者使用mtg染色结合流式细胞术分析了髓系细胞il-4ra缺陷的小鼠（il4ra mko）和wt小鼠损伤后14天时的mφ，与wt相比，il4ra mko小鼠mφ中线粒体显著降低，这表明晚期伤口mφ的线粒体生物发生依赖于il-4ra信号。那么，il-4ra ko对晚期损伤口mφ线粒体呼吸作用有何影响呢？ocr显示，与wt相比il-4ra mko小鼠晚期伤口mφ的基础呼吸、atp周转和剩余呼吸能力显著降低；ecar显示，从il-4ra mko小鼠的晚期伤口mφ糖酵解率显著降低。这表明，在晚期伤口mφ中il-4ra介导了m2型信号诱导线粒体生物发生和oxphos。

m2型信号通过抑制mitoisr参与dars2 ko中 mrc功能损伤的代偿

前期有研究发现，在非免疫细胞中，dars2 ko引起的mrc功能损伤会诱导代偿性应激反应，特别是线粒体综合应激反应（mitoisr），mitoisr的特征是atf4介导的单碳和叶酸途径、丝氨酸和脯氨酸分解代谢上调。那么，dars2 ko 的bmdm是否发生了mitoisr？

mitoisr参与m2型信号保护线粒体功能的代偿机制吗？作者发现，与wt相比，dars2 ko bmdm的全细胞裂解液中mrc亚基ndufb8、uqcrc2和cox1的蛋白水平较低。值得注意的是，虽然il-4 il-13刺激对wt细胞中的mrc蛋白水平没有显著影响，但是dars2 ko mφ中il-4 il-13刺激增强了mrc亚基ndufb8、uqcrc2、cox1和atp5a 的稳定性。这提示m2型信号增强了mrc亚基的稳定性。rna-seq分析显示，与wt相比，dars2 ko mφ中驱动mitoisr的关键转录因子atf4和ddit3/cho及其下游靶基因表达上调。il-4 il-13刺激消除了ddit3/chop的表达上调。这些结果表明，m2型信号可以减轻dars2 ko对线粒体功能的负面影响。

鉴于dars2 ko上调ddit3/chop的表达以及il-4 il-13下调ddit3/chop的表达，作者推测在伤口愈合的后期m2型信号可能减弱了mitoisr。qrt-pcr显示，在wt和dars2 ko小鼠的损伤后14天的伤口mφ中，mitoisr特征性转录因子atf4和ddit3/chop表达水平相当。这表明，愈伤后期m2型信号通过抑制mitoisr保护线粒体。

总 结

伤口愈合是一个高度协调的过程，单核/巨噬细胞是该过程的重要参与者，在促炎阶段参与抗菌，在促修复阶段参与组织重构。免疫细胞的功能变化常常伴随着代谢重编程，然而巨噬细胞在愈伤过程中的代谢重编程机制一直有待阐明。本文发现早期伤口mφ具有m1/糖酵解特征，晚期伤口mφ有m2/oxphos特征。早期伤口mφ中，细胞通过糖酵解和mrc产生mtros稳定hif-1α，促进促炎和促血管生成基因的表达；晚期伤口mφ中，细胞受m2型信号通过il-4ra-oxphos途径进行代谢重编程，促进mφ修复功能。该发现揭示了愈伤过程中的巨噬细胞代谢重编的调节机制，提供了增强伤口mφ的新靶点。

责编/jane

原文链接：

***/10.1016/j.cmet.2021.10.004